Molekulární genetika
Metody molekulární genetiky využívají přirozených vlastností kyseliny deoxyribonukleové (DNA), v jejíž dvouvláknové struktuře ve tvaru žebříku je genetická informace zapsána.
Příčle žebříku (base DNA) se vyskytují pouze ve čtyřech formách. Genetická abeceda má tedy jen čtyři písmena - A,G,C,T.
Při oplození každý dostal jeden úplný soubor lidských genů od matky (růžový žebřík) a druhý- stejný- soubor genů (modrý žebřík) od otce. Toto genetické věno pak obsahují všechny buňky všech orgánů jedince. Každý znak vzniká tedy realizací dvou projektů - genů, které mohou být v různém vztahu: například růžový gen- projekt mateřský úplně potlačí modrý otcovský. Je to výhodné v případě, kdy jeden z genů je poškozen.
DNA lze získat ze všech jaderných buněk. Zmraženou DNA lze uchovávat neomezeně dlouho v genových bankách.
Jednoduchými metodami (například zahřátím) je možno dočasně přerušit spojení mezi oběma vlákny (denaturovat) a vytvořit tak z žebříku hrábě. Návratem k původním podmínkám lze DNA zpět renaturovat do obvyklé a přesně zapadající dvojvláknové struktury (žebřík).
Po denaturaci DNA pacienta je možno do zkumavky přidat krátké, také denaturované (také hrábě) a označené kousky DNA z jiného zdroje o kterých je známo, že nesou určitou změnu - mutaci. Značené kousky DNA o známém složení se nazývají genové sondy (proby). Za renaturačních podmínek se sonda může vázat (hybridizovat = doplnit žebřík) s odpovídajícím úsekem DNA pacienta. Pokud dojde k hybridizaci se sondou a tedy k označení DNA pacienta, je podán důkaz přítomnosti hledaného genu.
Další vlastností DNA je schopnost vytvářet přesné kopie. Po denaturaci DNA na dvě podélná vlákna (hrábě) se za vhodných podmínek na každé z nich naváže enzym DNA polymeráza. Ten postupuje po obou vláknech "hrábí" a doplňuje (vychytává z okolního prostředí) stavební složky k vytvoření typického dvouvláknového "žebříku" DNA. Tak vzniknou dvě dvouvláknové kopie původní DNA. Této přirozené vlastnosti se využívá při umělém opakovaném kopírování (amplifikaci) určitého úseku DNA. V laboratorních podmínkách lze DNA polymerázu cíleně nasadit na určité místo a amplifikovat pouze určitou část DNA - třeba tu s mutací. Tato metoda se nazývá metoda polymerázového řetězce (zkratka PCR).
Sekvenování DNA je určení pořadí příček onoho žebříku DNA. Sekvenování je ono mediálně známé čtení genetického kódu. Na první pohled je to jednoduché čtení pouze čtyř písmen.
--------------------------------------------------------------------------------
Genetické DNA testy
Genetické testy odhalují neměnnou genetickou výbavu jedince. Mohou zjistit příčinu již patrných, ale nespecifických příznaků onemocnění (například záchvatů křečí nebo svalové slabosti) nebo označit jedince s vysokým rizikem vzniku závažné choroby v budoucnosti (například rakoviny prsu).
Přesné rozpoznání příčin onemocnění může přispět k cílené léčbě. Při zjištění rizika vzniku choroby v pozdějším věku je možno se pokusit o preventivní léčbu (například důsledné snižování cholesterolu v krvi již od dětství) nebo odnětí rizikového orgánu - např. mléčné žlázy a vaječníků po ukončení reprodukce.
Při průkazu genu způsobujícím závažnou neléčitelnou chorobu u zárodku nebo plodu může matka rozhodnout o ukončení těhotenství.
Výsledky genetických testů jsou na molekulární úrovni a jsou neměnné. Teplota nebo cholesterol mohou být jednou zvýšeny a jindy zase sníženy. Kombinaci genů dostává jedinec při oplození, rodí se s ní a také s ní umírá. Všechny genetické informace je tedy možno zjistit již v okamžiku oplození.
Někteří lidé nechtějí vědět co je čeká a nechtějí ani dodržovat preventivní opatření, která jim mohou prodloužit zdravý život. Existuje také nebezpečí zneužití výsledků genetických testů. Výsledkem by mohla být diskriminace v zaměstnání nebo při zdravotním a sociálním pojištění.
U genetického testování je nezbytná konzultace a informovaný souhlas pacienta před provedením a kvalifikovaná interpretace výsledků. Je jisté, že možnosti genetického testování se budou stále rozšiřovat a že DNA jednou uchovaná v genové bance bude moci být dále vyšetřována podle potřeby.
--------------------------------------------------------------------------------
Dědičná trombofilie - informace pro pacienty
Dědičná trombofilie ( vrozený sklon ke srážení krve). To sice přináší nositeli výhodu rychlejší zástavy krvácení při zranění nebo při porodu, ale v některých situacích - například v těhotenství nebo při dlouhodobém znehybnění - mají trombofilici vyšší riziko tromboembolické choroby (TEN). V cévách se jim tvoří krevní sraženiny, které mohou omezit průtok krve v životně důležitých orgánech ( např. plicích).
Geny dědičné trombofilie jsou předávány potomkům v různě závažných kombinacích podle genetické výbavy rodičů. Nejvýznamnějším dosud poznaným genem způsobujícím trombofilii je tzv. „Leidenská mutace“ (FVL), kterou dostal - ve většině případů pouze od jednoho rodiče- asi každý dvacátý Čech
Jedním z dalších rizikových faktorů TEN je hromadění aminokyseliny homocysteinu v krvi často související s dědičně podmíněným zpomalením metabolismu kyseliny listové (změny genu MTHFR). Při dlouhodobě sníženém přísunu kyseliny listové a vitaminů skupiny B homocystein poškozuje buňky výstelky cév a usnadňuje tak vznik krevních sraženin.
Opatření při nálezu dědičné trombofilie
Naučte se svůj genetický nález nazpaměť tak jako PIN Vaší kreditní karty, ale s tím rozdílem, že jej budete vždy hlásit při každé rizikové situaci (znehybnění, hormonální léčba, těhotenství, úrazy, operace, dlouhé cestování atd.). Pro tyto situace jsou propracovány postupy na „ředění“ krve a zlepšování vlastností cév heparinem, warfarinem a dalšími léčivy.
Každý může dlouhodobě dodržovat obecná preventivní pravidla: dostatečný přísun tekutin (2,5 litru/den) a pohyb (3 km chůze/den), stahování dolních končetin při dlouhodobém stání, udržování optimální hmotnosti (výška –100) a nekuřáctví.
Tak jako se pravidelně kontroluje cholesterol kontrolujte pravidelně i hladinu homocysteinu v krvi.
Doporučená strava při geneticky podmíněných změnách metabolismu kyseliny listové
Cílem je dodávat potravou dostatečné množství Kyseliny listové (acidum folicum) a dalších vitaminů skupiny B: Vitaminu B6 (pyridoxin) a Vitaminu B12 (cyanocobalaminum) a doplňovat potravu vitaminovými přípravky.
Kyselina listová: Doporučená denní dávka je 0,5 mg.
Před těhotenstvím nebo při zvýšené hladině homocysteinu v krvi Vám lékař může předepsat dávku až 5 mg denně.
Zdroj v potravinách: tmavě zelená listová zelenina, mrkev, vaječný žloutek, žlutý meloun, meruňky, avokádo, fazole, celozrnná tmavá mouka zvláště žitná, játra,kvasnice.
Vitamin B6: doporučená denní dávka 2 mg
Zdroj v potravinách: mléko, vejce, hovězí, zelí, žlutý meloun, pšeničné klíčky, otruby, pivní droždí (Pangamin).
Vitamin B12: doporučená denní dávka 6 µg
Zdroj v potravinách: ryby, játra, ledviny, maso zejména hovězí a vepřové , vejce, mléko, mléčné výrobky, sýr.
Nízká hladina vitaminu B12 je jak patrno častější u vegetariánů.
Obsah přirozených vitaminů v potravě se snižuje při tepelné úpravě a při konzervaci.
Vstřebávání vitaminů je sníženo při kouření, při dlouhodobém užívání léků a onemocněních trávicího ústrojí.
Multivitaminové přípravky s kyselinou listovou
Kyselina listová a vitaminy skupiny B jsou součástí většiny volně prodejných multivitamínových přípravků. Srovnejte doporučené dávky vitaminů se složením Vašeho přípravku – případně se poraďte s lékárníkem. Pokud je nutná vyšší dávka vitaminů, je nutný lékařský předpis a pravidelné kontroly.
Speciálně pro snížení hladiny homocysteinu je určen přípravek Metavit nebo Kardioprotektin.
Multivitaminové přípravky nejsou antibiotika a nemusí se užívat přesně na hodinu. Nic se nestane pokud občas vynecháte nebo přípravek změníte. Důležité je dlouhodobné podávání.
--------------------------------------------------------------------------------
Hereditární trombofilie – indikace k vyšetření a interpretace výsledků (pro lékaře)
Indikace k vyšetření hereditární trombofilie
Pozitivní tromboembolická anamnesa - TEN, CMP, TIA ve středním věku.
Pozitivní reprodukční anamnesa:
SAB ve II. trimestru, fetus mortuus, IUGR, preeklampsie, TEN v graviditě
Abrupce + embolizace placenty, trombosa pupečníku, perinatální i.c. hemoragie
Opakované neúspěchy při asistované reprodukci (ART) + příprava na ART.
Pozitivní anamnesa před předpisem HAK (hlavně s progestiny III. generace) a HRT.
Testy trombofilie lze rozdělit do III. Skupin
Genetické ( vyšetření čtyř mutací tří genů)
Leidenská mutace (G1691A) genu pro faktor V (FVL).
Doplňkové
Mutace (G20210A) genu pro prothrombin (F II)
Polymorfismy (C677T + A1298C ) genu pro MTHFR (folát reduktázu)
Koagulační
Protein C + S, APCR, APTT, fibrinogenemie atd.
Serologické a biochemické
Antifosfolipidové protilátky
Homocysteinemie
Incidence heterozygotů v běžné populaci pro nejvýznamnější Leidenskou mutaci (FVL) je 5,7 – 8,3%. Homozygoti jsou vzácní. Heterozygoti pro FVL mají 4-8 x vyšší relativní riziko vzniku (TEN). Při expozici pohlavním hormonům (HAK, HRT) je to riziko až 30 násobné. Další rizikové faktory jsou vyšší věk, kouření, nadváha, pohybový režim a pozitivní anamnesa. Riziko TEN se dále zvyšuje při přítomnosti dalších mutací (FII, MTHFR) a může být až 100 násobné.
Schema: Při vyšetřování klinických případů TEN jsou indikována všechna nezbytná vyšetření dle indikace ošetřujícího lékaře, včetně vyšetření trombofilních mutací. V případě průkazu vlivu hereditárních faktorů (FVL, FII mutace) je indikováno vyšetření těchto mutací u členů rodiny dle genealogie a klinické závažnosti (např. mladší příbuzní ženského pohlaví před reprodukcí) (provádí diagnostikující lékař – možno spolu s genetikem). Zdá se že DNA analýza má v této indikaci výhody před vyšetřením hematologickým.
Bezpříznakovým členům rodiny s identifikovanou mutací je doporučena tromboprofylaxe v zátěžových situacích (vede hematolog)
Indikuje:
Příslušný odborný lékař ošetřující pacienta s TEN nebo s pozitivní anamnesou (jmenovitě neurolog, flebolog, hematolog, porodník atd.)
Genetik při pozitivní genealogické studii
--------------------------------------------------------------------------------
Konsensuální stanovisko k indikacím vyšetření Leidenské mutace
(FVL – faktor V Leiden) před doporučením kombinované hormonální
kontracepce (COC) či hormonální substituční léčby (HRT)
1Cibula, D., 2Kvasnička, J., 3Salaj, P., 3Vorlová, Z., 4Unzeitig, V., 1Živný, J.
1Gynekologicko-porodnická klinika I. LF UK a VFN v Praze, přednosta prof. MUDr. J. Živný, DrSc.
2I. interní klinika, Oddělení klinické hematologie, I. LF UK a VFN v Praze, přednosta prof. MUDr. P. Klener, DrSc.
3Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, přednosta MUDr. Petr Cetkovský
4Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN, Brno, přednosta prof. MUDr. P. Ventruba, DrSc.
Každá žena by měla být před začátkem užívání COC nebo HRT poučena o vyšším riziku tromboembolické nemoci (TEN) a nutnosti vysazení přípravků v rizikových situacích (operace, imobilizace). Součástí poučení by měla být informace o časných příznacích hluboké žilní trombózy.
Screeningové vyšetření Ledienské mutace (FVL) u všech žen před doporučením užívání pohlavních steroidů není v současnosti indikováno. Hlavním důvodem je ekonomická náročnost.
Před doporučením COC či HRT by měla být zjištěna rodinná anamnéza hluboké žilní trombózy a plicní embolie v první a druhé příbuzenecké linii. Při zatížené rodinné anamnéze musí být žena poučena o vyšším riziku TEN, které je přítomné i při absenci vrozených poruch koagulace. Pokud je to možné, měla by být zvolena nehormonální metoda kontracepce. V případě, že žena při vědomí zvýšeného rizika zvažuje užívání hormonů nebo pokud je k jejich užívání zdravotní indikace, je indikované vyšetření FVL, event. dalších vrozených trombofilií.
Obezita (BMI > 30) je závažným rizikovým faktorem TEN. U obézních žen lze doporučit stejný postup jako u žen s pozitivní rodinnou anamnézou. Žena musí být poučena o zvýšeném riziku TEN, které je důsledkem její vysoké hmotnosti. Preferovány by měly být nehormonální metody kontracepce. V případě, že žena při vědomí zvýšeného rizika zvažuje užívání hormonů nebo pokud je k jejich užívání zdravotní indikace, je indikované vyšetření FVL, event. dalších vrozených trombofilií. V těchto případech však nelze očekávat častější záchyt FVL jako u skupiny s pozitivní rodinnou anamnézou.
Heterozygotní nosičství FVL je relativní kontraindikací COC i HRT. Žena musí být poučena o významně zvýšeném riziku TEN. Některé vrozené poruchy koagulace (deficit antitrombinu III, deficit proteinu C, homozygotní forma FVL), stejně jako kombinace několika poruch, musí být respektovány jako absolutní kontraindikace COC i HRT.
Potvrzená diagnóza žilní trombózy v osobní anamnéze je absolutní kontraindikací COC i HRT.
Ženy s prokázanou Leidenskou mutací nebo jinou hereditární trombofilií by měly být dispenzarizovány v trombotických centrech.
Pozn.: Rozbor problematiky viz „Cibula, D, Unzeitig, V, Živný, J.:Vyšetřování Leidenské mutace (FVL – Leidenská mutace faktoru V) u žen v souvislosti s užíváním kombinované hormonální kontracepce nebo hormonální substituční léčby. Česká gynekologie, 2003, 3, (v tisku).
--------------------------------------------------------------------------------
Dědičná resistence k aktivovanému proteinu C (APC),
Factor V Leiden (FVL) Mutace
Záměna DNA base guaninu za adenin v 1691 nukleotidu (G1691A) genu pro hemokoagulační Faktor V umístěném na chromozomu č.1 (1q23) se nazývá podle místa objevu Factor V Leiden (FVL) mutace. Tato bodová mutace vede k záměně aminokyseliny argininu za glutamin na 506 pozici faktoru V. Zde je umístěno vazebné místo pro aktivovaný inhibitor koagulace - protein C (APC). APC se na Faktor V Leiden obtížněji váže - klíč neodpovídá zámku - a následkem je prodloužení aktivity Faktoru V a zvýšená basální pohotovost ke srážení krve (trombofilie) při hyperkoagulačních stavech (např. znehybnění, hormonální léčba, gravidita, úrazy, operace, dlouhé cestování).
FVL mutace pravděpodobně vznikla před 20 000 -30 000 lety a její nosiči měli určitou výhodu rychlejšího stavění krvácení při zranění, těhotenství a porodu. Změny zevních podmínek předbíhající konzervativní genom však tuto druhdy selekční výhodu relativizují.
Pokud je pacientovi mutovaný gen předán pouze od jednoho rodiče (FVL mutace je v heterozygotním stavu) jsou příznaky obvykle mírné protože „zdravý“ gen od druhého rodiče zajišťuje, že polovina faktoru V, který je syntetizován v játrech, má normální strukturu a je pod kontrolou proteinu C. Pokud jsou ale oba rodiče heterozygotní nosiči a oba předali svému potomkovi mutovaný gen, je pohotovost ke srážlivosti krve výrazná ( FVL mutace u potomka je v homozygotním stavu).
Vzhledem k ovlivnění průběhu těhotenství mohou vznikat u FVL heterozygotních matek tři možnosti: plod je heterozygot, homozygot ( když je i otec heterozygotem) nebo nenese mutovaný gen vůbec.
Pokud je matka homozygotem FVL mutace pak její plod má podle stavu otce dvě možnosti: buď je heterozygot nebo opět homozygot. Lze se domnívat, že tato poslední kombinace bude reprodukčně nejrizikovější.
Diagnosa. Na FVL mutaci nutno pomýšlet v těchto situacích:
Výskyt trombembolické choroby (TEN) a ischemické srdeční choroby (ICHS) před 50 lety věku
Opakovaná TEN ( též u členů rodiny)
Trombosa na neobvyklém místě (centrální nervový systém, trávicí trakt, retinální artérie, bércový vřed)
TEN při těhotenství, při užívání hormonů včetně antiestrogenů
Porodnické komplikace hlavně ve II - III trimestru a šestinedělí
Pozitivní anamnesa (TEN, nadváha, kouření, věk) při úvaze o předpisu perorální antikoncepce (HAK) nebo substituční hormonální léčby (HRT).
Před stimulací při asistované reprodukci (ART)
Relativní riziko TEN u heterozygotů FVL je 3-30 násobné. U homozygotů a nosičů dalších mutací je relativní riziko TEN až 100 násobné.
Laboratorně se používá k průkazu koagulační a molekulárně genetické vyšetření:
koagulační vyšetření (nespecifická APC resistence- assay II. generace)
molekulárně genetické vyšetření (RFLP Mnl polymorfismus FV genu na chromozomu 1q23. Toto vyšetření se preferuje hlavně u příbuzných s prokázaným srážlivým stavem.
Prevalence heterozygotů je mezi 1/10 v Skandinavii a Řecku do 1/50 v Itálii a Španělsku. U nás je incidence heterozygotů asi 1/20. Zjištěná frekvence homozygotů je nízká (asi 1/5000) a neodpovídá Hardy-Weinbergovu (HW) zákonu. To může znamenat selekční nevýhodu homozygotů až 30% antenatální letalitou.
Předpoklad dle HW zákona
Incidence Heterozygotů Manželství heterozygotů Incidence homozygotů Incidence matka+plod heterozygoti
1/20 1/400 1/1600 (?) 1/400
FVL mutace není jedinou příčinou APC rezistence, i když představuje asi 95% případů. Dalšími příčinami jsou např. zvýšení srážlivých faktorů VIII, IX, XI, SLE protilátky, ACA protilátky atd). Koinheritance s další častou mutací genu pro prothrombin FII G20210A popsána s frekvencí 1/1000. Vzácné jsou další mutace vedoucí k deficienci proteinu C, S a antitrombinu. Daším kofaktorem je hyperhomocysteinemie jak získaná tak vrozená následkem polymorfismu genu pro MTHFR nebo antifosfolipidové protilátky (ACA).
Diagnosa: Akutně nemocný TEN je vyšetřován všemi dostupnými metodami dle doporučení konzilia vedeného hematologem. Pokud byla diagnostikována přítomnost FVL mutace, mělo by být u rizikových příbuzných doplněno vyšetření FII G20210A mutace, MTHFR mutací, ACA protilátek a homocysteinemie. Vyšetřovat by se měly hlavně příbuzní I. stupně s pozitivní anamnesou, ženy plánující graviditu, HAK nebo HRT.
Léčba: Heparin injekčně na počátku a následně Warfarin v tabletách. Zatím není známo, zda FVL či kombinace mutací vyžaduje jiný léčebný režim než jiné příčiny TEN.
Profylaxe: U asymptomatických heterozygotů FVL je doporučena úvaha o krátkodobé profylaxi při hemostatických stresových situacích. Nutná je péče o dostatečnou hydrataci, pohybový režim, udržování optimální hmotnosti a nekuřáctví.
V graviditě se u asymptomatických heterozygotů primárně nedoporučuje medikamentosní profylaxe. V úvahu přichází Dopplerometrické monitorování venosního průtoku na DK. V puerperiu je nutno uvážit warfarinizaci.
Jiná situace je u homozygotů, nosiček kombinovaných mutací a těhotných s pozitivní anamnesou. Zde je v těhotenství indikovaný heparin a warfarinizace v šestinedělí. U nosiček FVL je nutno zvážit druh antikoncepce. Zdá se, že kombinovaná p.o. kontraceptiva (COC) obsahující gestageny III. generace (gestoden) jsou rizikovější než pouze gestagení antikoncepce. Též je nutno zvážit HRT versus jiné způsoby prevence
osteoporozy.
--------------------------------------------------------------------------------
Hereditární hemochromatosa (HHC)
Hereditární hemochromatosa (HHC) je dědičná- autosomálně recesivní- porucha metabolismu železa, projevující se střádání železa v játrech, pankreatu, srdci, kloubech a hypofyse. Neléčená HHC může končit fatálně cirhosou , primárním hepatomem, diabetem nebo kardiomyopathií.
Gen pro HCC (HFE), byl lokalizován na krátkém raménku chromosomu č. 6 (6p21.3). Z dosud poznaných 37 alelických variant HFE genu jsou s HHC významně asociovány dvě: C282Y a H63D.
C282Y mutace vzniká záměnou Guaninu Adeninem na 845 nukleotidové pozici HFE genu (845GaA). Výsledkem je náhrada aminokyseliny (AMK) cysteinu tyrosinem na pozici č. 282 HFE proteinu.
H63D mutace vzniká záměnou Cytosinu Guaninem na 187 nukleotidové posici HFE genu (187CaG). Výsledkem je náhrada histidinu aspartátem na AMK posici č. 63 HFE proteinu.
Homozygozita C282Y (YY) mutace je přítomna u 52-100% klinicky diagnostikovaných pacientů s HHC. V těchto případech byl mutovaný gen předán nemocnému zároveň oběma rodiči, kteří oba byli minimálně heterozygoty. 5 % pacientů s HHC jsou složení heterozygoti- C282Y(CY) /H63D(HD) a 1,5% nemocných pacientů je homozygotních pouze pro H63D (HD) mutaci.
Onemocnět mohou i C282Y (CY) heterozygoti (3,6% nemocných) , také H63D (HD) heterozygoti (5,2% nemocných). Zdá se, že v těchto případech mají vyšší riziko příznaků HHC heterozygoti, kteří zdědili HFE mutaci od otce.
Naopak u 7% nemocných s HHC není zjištěna ani C282Y ani H63D mutace.
Z těchto údajů je patrné, že při vzniku onemocnění se uplatňují mutace jiných modifikujících genů (např. geny pro transferin, transferinový receptor atd) spolu s vlivy zevního prostředí (dietní přísun železa a inhibitorů jeho vstřebávání, krvácení do zažívacího traktu, alkohol atd).
Průměrná populační frekvence homozygotů C282Y (YY) je 0.4% (1/250). Průměrná frekvence heterozygotů mutace C282Y (CY) u Evropanů je 9.2% (1/10). Jsou popsány rozdíly: např v Severním Irsku je frekvence heterozygotů až 14% (1/6). Ve východní a jižní Evropě je to asi 2-3% (1/32). C282Y mutace je tedy mutace „keltská“.
Frekvence H63D (HD) heterozygotů je v evropské populaci 22% (1/4).
V Asii, Africe, Indii a Středním východě jsou HFE mutace vzácné.
Asi u 40-70% osob homozygotních pro C282Y (YY) mutaci bude v průběhu života laboratorně zjištěno střádání železa. Jen asi 3% z nich bude zjištěna hepatopathie a plně vyjádřená HHC propukne asi u 2%. Odhadovaná prevalence HHC je 51 - 64/10000 při přísných diagnostických kriteriích (průkaz jaterní biopsií). Pokud se hodnotí pouze saturace transferinu nad 50% (fysiologicky je transferin saturován železem do 30%), pak je prevalence 80/10000.
HFE Gen
Klinické příznaky HHC jsou nejčastěji asociovány s HLA A3 genem na krátkém raménku chromozomu č.6. Feder et al. roku 1996 identifikoval 250-kilobázovou oblast lokalizovanou více než 3 megabase telomericky od HLA oblasti, která byla nazvána původně HLA-H (později HFE ). Dvě missense mutace v této oblasti (C282Y a H63D) byly přítomny u 88 % HHC pacientů. Přesná lokalizace HFE loku je 6p21.3- asi 4,6 megabasí telomericky od HLA-A. Samotný HFE lokus tvoří přibližně 10 kilobasí.
Produkt HFE genu - HFE protein- je transmembránový protein associovaný s beta2-mikroglobulinem. Normální HFE protein se váže s transferinovým receptorem a 5-10 krát redukuje jeho afinitu k transferinu – hlavnímu transporteru železa. C282Y mutace mění strukturu HFE proteinu a jeho asociaci s beta2-mikroglobulinem. Konsekvence H63D mutace nejsou tak zřejmé. HFE protein je exprimován buňkami duoenálních krypt a svou asociací s transferinem reguluje vstřebávání železa .
C282Y mutace vzniká záměnou Guaninu Adeninem na 845 nukleotidové pozici HFE genu (845GaA). Výsledkem je substituce cysteinu tyrosinem na AMK pozici č. 282 HFE proteinu. H63D mutace vzniká záměnou Cytosinu Guaninem na 187 nukleotidové posici HFE genu (187CaG). Výsledkem je substituce histidinu aspartátem na AMK posici č. 63 HFE proteinu.
Zatím je popsáno celkem 37 mutací HFE genu. ( 9 jiných missense mutací vedoucích s AMK substituci a intronické polymorfismy).
Klinika HHC:
Phenotyp HHC je komplexní a záleží na řadě exogenních vlivů (věk, pohlaví, dietní přísun železa, alkohol, infekce atd).
Časné příznaky jsou nespecifické : únavnost, slabost , bolest kloubů, srdeční palpitace, a bolesti břicha. K příznakům plně vyjádřené choroby patří kožní hyperpigmentace, artritida, cirhosa, diabetes, chronická bolest břicha, chronický únavový syndrom, letargie, hypopituitarism, hypogonadism se ztrátou libida, kardiomyopathie, primární hepatom (relativní riziko je 200 !) a zvýšené riziko některých infekcí (GIT).
Prvním znamením při objektivním vyšetření je hepatomegalie. Při diagnose je u 22-60% nemocných již přítomna cirhosa. Hepatocellulární karcinom byl příčinou 30-45 % úmrtí nemocných s HHC. U všech pacientů s hepatocellulárním karcinomem je HHC přítomna u 11-15 %.
Diabetes mellitus a hypogonadism u pacientů s HHC souvisí se střádáním železa v pankreatu a hypofyse. Kardiomyopathie a arytmie přecházející do srdečního selhání je přítomna u 7-36 % nemocných. Zvýšená tvorba melaninu vede k hyperpigmentacím u 27- 85% pacientů. Může se též vyskytnout ztráta vlasů, atrofie kůže a koilonychie (dystrofie nehtů). Arthropatie jsou přítomny u 40-75% a mohou postihnout metakarpální a metatarsální klouby ale i zápěstí, lokty a kolena
Symptomy se obvykle objevují mezi 40-60 rokem života. U žen vzhledem ke menstruačním ztrátám později. Choroba u mužů se projeví častěji hepatopathií. U žen je to spíše chronická únava , arthralgie a pigmentace. Neléčená HHC obecně snižuje délku života. Hlavním faktorem závažnosti onemocnění je vznik jaterní cirhosy. K té se často přidružuje diabetes. Zdá se, že úspěšné snížení obsahu železa je spojeno se zlepšením prognosy.
Léčba:
Bezpečným a efektivním terapeutickým opatřením jsou opakované venepunkce pokud sérový ferritin dosáhne 300µg/L u mužů a 200µg/L u žen. Nosič HFE mutací je vhodným kandidátem dárcovství krve.
Doporučuje se vynechat dodatky výživy obsahující železo a vysoké dávky vitaminu C. Vápník a fosfor (mléko) a tannin (čaj) a kyselina šťavelová snižují vstřebávání železa. Zdá se nosiči HFE mutací mají snížené vstřebávání chromu a mají vyšší riziko otravy olovem.
Nositelé HFE mutací jsou senzitivnější na některé střevní patogeny (Vibrio vulnificus a Salmonella enteritidis) přítomné např. v syrových rybách.
Při snížení obsahu železa lze očekávat úpravu většiny známek onemocnění. Léčba orgánových komplikací onemocnění není u nemocných s HHC nijak specifická.
Snížení obsahu železa zvyšuje šanci na úspěch léčby hepatitidy C.
Zatím není zjištěno, zda je nosičství HFE mutací častější u nemocných s diabetem II. typu. Venepunkce by v těchto případech mohla mít aditivní terapeutický efekt.
Laboratorní vyšetření:
Standardním vyšetřením je zjištění saturace tranferinu (TS) a koncentrace feritinu (SF). (TS = koncentrace sérového železa / celková vazebná kapacita železa x 100). Zvýšená TS je často přítomna před klinickými projevy HHC. Prahová hodnota TS je 50 %. 24 hodin před vyšetřením TS by neměly být užívány výživové přídavky s železem a vitaminem C. Hodnota TS by měla být potvrzena dvojím vyšetřením. Zvýšení koncentrace SF koreluje s klinickými příznaky a při současném nálezu zvýšení TS a SF je indikována jaterní biopsie k vyloučení jiných příčin (alkoholická hepatopathie, hepatitida, chronický zánět, neoplasie atd) .
K základnímu laboratornímu vyšetření patří i jaterní testy a krevní obraz.
DNA analýza: i při průkazu známých mutací je nutno uvažovat o dalších modifikujících genech a významném vlivu zevního prostředí. Prognosticky je nejvýznamnější nález homozygocie alely C282Y (YY).
Klinické příznaky se u nosičů projeví pouze u části (do 3%).
DNA analýza slouží k vyhledávání potenciálně rizikových příbuzných pacientů s prokázanou HHC a zatím není použitelná pro populační skríning.
--------------------------------------------------------------------------------
Polymorfismy genu pro MTHFR
(methylentetrahydrofolát reduktazu)
Enzym 5,10 methylentetrahydrofolát reduktaza (MTHFR) katalyzuje konversi 5,10 methylentetrahydrofolátu na 5-methyl-tetrahydrofolát, který je hlavní formou folátů v organismu. Foláty slouží jako dárci monokarbonů (organických skupin s jedním uhlíkem - např. CH2, CH3, C=O) pro mnoho metabolických reakcí včetně metylace homocysteinu a syntesy nukleotidů, neurotransmiterů proteinů a fosfolipidů.
Lokus genu pro MTHFR je na chromozomu č. 1 (1p36.3). Byly popsány 2 poměrně časté polymorfismy tohoto genu mírně snižující aktivitu MTHFR - tzv. „termolabilní polymorfismus“ C677T (záměna Cytosinu Thyminem v 677 nukleotidu) a polymorfismus C1298A (záměna Cytosinu Adeninem v 1298 nukleotidu).
Termolabilní polymorfismus C677T je rizikovým faktorem vzniku defektů neurální trubice (NTD). Relativní riziko vzniku NTD u plodů matek C677T homozygotních je si 2 x zvýšené proti plodům matek s normálním genotypem. Riziko se zvyšuje až 5x při nedostatku folátů. Genotyp otců se uplatňuje hlavně při kombinaci heterozygotní otec / homozygotní plod. Pokud jsou oba matka i plod homozygotní je relativní riziko vzniku NTD sedminásobné. Polymorfismus C677T a zevní folátový deficit odpovídají asi za 6% případů NTD.
V případě sníženého přísunu nebo vstřebávání přirozených folátů a dalších vitaminů skupiny B (například při kouření, léčbě antepileptiky, onemocněních trávicího traktu nebo ledvin) může být u nosičů C677T zpomalena methylace homocysteinu na methionin. Výsledkem je zvýšená hodnota homocysteinu v krvi (= homocysteinemie), která je nezávislým rizikovým faktorem vzniku kardiovaskulárních chorob. Nositelé C677T polymorfismu mají asi o 16% vyšší riziko vzniku kardiovaskulárního onemocnění. Riziko kardiovaskulárních chorob se dále zvyšuje při nálezu dalších (tzv. trombofilních) mutací genů pro koagulační faktory (Leidenská mutace, mutace protrombinového genu).
Výhodou nosičů polymorfismu genu pro MTHFR je až o 50% nižší riziko vzniku některých nádorů (například trávicího ústrojí), zvláště při optimálním přísunu vitaminů skupiny B.
Zdá se, že nosičství polymorfismu A1298C je též spojeno s rizikem NTD a není vyloučeno, že přítomnost obou polymorfismů v heterozygotním stavu má podobný teratogenní a metabolický efekt jako samotná homozygocie pro C677T. Přítomnost tří nebo dokonce čtyř polymorfních alel (677 TT / 1298 CC) může být za určitých okolností ( např. nízký přísun vitaminů skupiny B) a při přítomnosti mutací dalších genů letální a může být příčinou spontánního potratu.
Prevalence C677T polymorfismu v Evropě kolísá mezi 22 - 40 % od severu na jih. To znamená že např. v některých oblastech Itálie je každý druhý heterozygotem a každý šestý je homozygotem 677 TT. Prevalence polymorfismu A1298C je podobná.
Prevalence složených heterozygotů C677T / A1298C kolísá od 11- 20%.
Opatření při nálezu polymorfismu MTHFR genu:
U nosičů by měla být pravidelně sledována homocysteinemie (stejně jak se sleduje např. cholesterol a glykemie).
Výživa bohatá na vitaminy skupiny B (kyselina listová, vitamim B6, B12) by měla být doplněna vitaminovou suplementací nejlépe multivitaminovými preparáty (Metavit, Materna pro těhotné atd.). Doporučená denní dávka Acidum folicum je pro heterozygoty 400ug. Dávka pro homozygoty je 5 mg/den. Dalším lékem pomáhajícím stabilizovat metabolismus monokarbonů je acetylcystein. Nosičství polymorfismu genu pro MTHFR je dalším důvodem pro nekuřáctví a snahu o optimální hmotnost.
Zvláštní pozornost by měla být věnována nosičům MTHFR polymorfismů, kteří užívají antiepileptika, hypolipidemika nebo jsou léčeni pro onemocnění trávicího traktu. Opatrnosti je třeba při anestezii oxydem dusným.
--------------------------------------------------------------------------------
Ztráta sluchu podmíněná mutací genu po Connexin-26
Těžká porucha až ztráta sluchu se vyskytuje s frekvencí 1/1000 obyvatel a nejméně u poloviny případů je příčina genetická. Většina sluchově postižených na genetickém základě má zdravé rodiče a výskyt poruch sluchu pozorujeme spíše v jedné generaci sourozenců obojího pohlaví. To je jedním ze základních znaků autozomálně recesivní (horizontální) dědičnosti, kdy změněný (mutovaný) gen dostal postižený od obou zdravých rodičů - přenašečů.
Sluchové poruchy mohou být jediným postižením (izolované) nebo se vyskytují sdružené s jinými vadami v syndromech. Například Usherův syndrom sdružuje vady sluchu a zraku, při Pendredově syndromu je kromě sluchu postižena i štítná žláza. Sticklerův syndrom je zase charakterizován kromě smyslových vad i postižením kloubů.
Pokud je porucha sluchu přítomná před vývojem řeči hovoříme o prelinguální poruše , pokud se projeví až po rozvoji řeči jde o postlinguální poruchu.
Asi u poloviny pacientů s izolovanou prelinguální poruchou sluchu je možno nalézt příčinu v mutaci genu pro bílkovinu connexin-26 (Cx26) ,který je umístěn na chromozomu č.13 (13q12). Na tomto místě označovaném DFNB1 je také gen pro connexin-30 s podobnou funkcí.
Bílkoviny zvané connexiny se účastní vyváření komunikačních spojek mezi buňkami. Následkem mutace genu je změněná struktura connexinu 26 a porucha spojení buněk vnitřního ucha. Nejčastější mutace genu pro connexin 26 se označuje 35delG - kdy ve struktuře genu chybí jediná base - Guanin . Tato mutace je dosti rozšířena a přenáší ji asi každý třicátý zdravý obyvatel. U části postižených byly nalezeny také mutace genu pro connexit-30.
Molekulárně genetické vyšetření může zjistit jak příčinu poruch sluchu tak bezpříznakové nosičství mutace a tedy i nebezpečí postižení dalších členů rodiny.
--------------------------------------------------------------------------------
Delece Y chromozomu
Genetické vyšetření při mužské neplodnosti
Téměř u poloviny neplodných párů se při vyšetření spermií partnera nachází malá koncentrace (pod 20 mil/ml) a pohyblivost spermií – oligoasthenospermie (OAS) nebo úplné chyběním spermií – azoospermie. Techniky asistované reprodukce umožňují i při závažné OAS nalézt pod mikroskopem jednotlivé spermie s přijatelnými funkčními vlastnosti a injikovat je do vajíčka (ICSI). I v případě azoospermie je možno získat funkční spermie punkcí nadvarlete nebo preparací testikulární tkáně (MESA,TESE). Při přípravě neplodného páru s „mužským faktorem“ k asistované reprodukci (ART) je nutno vyloučit několik relativně častých genetických příčin s rizikem přenosu mužské sterility do další generace nebo koncepce nebalancovaného embrya.
Chromozomální vyšetření zaměřené na balancované translokace kdy je určitý blok (bloky) genů umístěn na jiné pozici. Nositel má funkčně úplný genom a není nijak postižen, ale při vývoji spermií může docházet ke vzniku nebalancovaných spermií, které budˇ zaniknu nebo jsou morfologicky a funkčně subnormální. Oplození nebalancovanou spermií může být příčinou syndromu mnohočetných vad.
Chromozomální vyšetření zaměřené na počet a morfologii pohlavních chromozomů X a Y. Pokud je při tomto vyšetření s citlivostí řádově stovek genů zjištěna patologie, je možno očekávat postižení více orgánů – např. Klinefelterův syndrom, syndrom XYY nebo malý vzrůst a hypoplasii varlat. Šance na úspěch ART je v tomto případě nízká, ale pokud jsou u nositelů těchto chromozomálních vad získány spermie vhodné pro ICSI, je možné očekávat zdravé potomstvo.
Vyšetření nejčastějších mutací genu pro cystickou fibrosu (CFTR). Azoospermie způsobená uzávěrem nebo vrozeným chyběním chámovodu (CBAVD) nebo závažná OAS může být známkou autosomálně recesivního onemocnění cystickou fibrozou (CF) nebo přenašečství mutovaného genu. Až 95% mužů s CF má azoospermii a u některých je porucha plodnosti jediným příznakem onemocnění. V naší populaci je relativně vysoká frekvence klinicky zdravých přenašečů ( u nás asi 1/ 29). Toto riziko má tedy i každá zdravá partnerka pacienta vyšetřovaného pro sníženou plodnost. Pokud jsou oba rodiče přenašeči, jejich potomek má 25% riziko plně vyjádřené choroby při které je porušena činnost žláz s vnější sekrecí (např. slinivky, bronchiálních a potních žláz). U nejzávažnější formy CF se opakují devastující plicní záněty, které významně zkracují život postižených. U mužů s poruchami plodnosti vyšetřujeme metodami molekulární genetiky šest nejčastějších mutací genu pro CFTR (delta F508, del21kb, G551D, N1303K, G542X, R117H), které představují přes 85% známých mutací CFTR genu v české populaci. Pokud je zjištěno nosičství mutace R117H, doplňujeme vyšetření 5T/7T/9T polymorfismu. Při vyloučení nosičství těchto nejčastějších mutací i u partnerky je riziko postižení jejich potomka CF nižší než 1/40 000. Při průkazu nosičství mutace je možná prenatální nebo preinplantační diagnosa.
Vyšetření submikroskopických ztrát genů (delecí) na dlouhém raménku chromozomu Y metodami molekulární genetiky. Na dlouhém raménku chromozomu Y jsou tři oblasti AZF (AZoospermia Factors) – a,b,c kde jsou umístěny geny regulující vývoj spermií (Viz obrázek). Tyto delece vznikají většinou de novo jako nehoda v oplodňující spermii nebo v prvních buňkách embrya. Postižení muži byli doposud neplodní a Y delece představují až 10% příčin těžkých forem neplodnosti. Delece v oblasti AZFa je obvykle nejzávažnější. Příznaky delece v AZF b + c oblastech jsou rozmanitější. Od úplného chybění zárodečných buněk v kanálcích varlete až po rychle se snižující plodnost s věkem. Vyšetřujeme přítomnost těchto markerů: sY84 , sY86 (AZFa na Yq11.21) , sY127, sY134 (AZFb na Yq11.22) , sY254 , sY255 ( AZFc na Yq11.23) spolu se dvěma kontrolními oblastmi (ZFY, SRY) na krátkém raménku chromozomu Y. Pomocí ART je v současné době možné, aby muži s delecí Y chromozomu měli potomstvo. Je však nutno očekávat, že jejich synové budou mít tutéž mutaci a budou neplodní. Dcery budou pravděpodobně zdrávy. Při průkazu delece Y chromozomu je tedy možno diskutovat o preinplantační volbě pohlaví.
--------------------------------------------------------------------------------
AmnioPCR (rychlé prenatální genetické vyšetření)
Standardním prenatálním genetickým vyšetřením je hodnocení bloků genů (chromozomů) v jádrech buněk plodu získaných z plodové vody, placenty nebo jiných tkání plodu. Po zmnožení buněk v laboratorních podmínkách se chromozomy hodnotí mikroskopem. Celé vyšetření trvá 2-3 týdny.
V některých případech je indikováno rychlé vyšetření nejčastějších vad chromozomů metodou AmnioPCR:
Při riziku neúspěchu standardního vyšetření v pokročilých stadiích těhotenství, při zhoršené kvalitě plodové vody nebo při vyšetření spontánního potratu.
Při ultrazvukovém průkazu vad utváření plodu.
Při vysokém riziku postižení plodu zjištěném krevním testem (např. riziko Downova syndromu, Edwardsova syndromu, Turnerova syndromu atd ).
Pro průkaz pohlaví plodu při riziku na pohlaví vázaných chorob.
Pro psychický stav matky – například při komplikovaném těhotenství po dlouhodobé léčbě sterility a asistované reprodukci.
Při AmnioPCR se metodou reakce polymerázového řetězce (PCR) zmnoží určité úseky genů (DNA) a následně se vyšetřují laserovým analyzátorem v tenké kapiláře (kapilární elektroforézou). Pokud je podezření například na Downův syndrom (plod má ve všech buňkách tři chromozomy č. 21) je možno zjistit po cílené PCR reakci tři různé úseky DNA pocházející pocházející z chromozomu č. 21 a tak diagnosu potvrdit.
Výsledky AmnioPCR jsou obvykle vydávány do 24 hodin.
AmnioPCR může zjistit až 90% nejzávažnějších vad počtu chromozomů (aneuploidií) s nízkým rizikem falešné pozitivity nebo negativity. S jistotou vyloučí postižení plodu Downovým syndromem. Celé vyšetření je uzavřeno mikroskopickou analýzou chromozomů za obvyklé 2-3 týdny.
K vyšetření metodou AmnioPCR stačí množství buněk, které je obsažené asi v mililitru plodové vody. Při transportu plodové vody do molekulární laboratoře není nutno dodržovat žádné speciální podmínky.
Touto metodou lze vyšetřovat i fixované neživé buňky potracených plodů.